vmest.ru страница 1страница 2страница 3
скачать файл




На правах рукописи
ШУМИЛОВ

Петр Валентинович

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ И ТЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ КРОНА И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЯЗВЕННОГО КОЛИТА У ДЕТЕЙ

14.01.08 – педиатрия

14.01.28 - гастроэнтерология
Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва – 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России»
Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор Мухина Юлия Григорьевна

доктор медицинских наук,

профессор Потапов Александр Сергеевич
Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Римарчук Галина Владимировна
доктор медицинских наук,

профессор Коровина Нина Алексеевна


доктор медицинских наук,

профессор Калинин Андрей Викторович


Ведущая организация:

ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский институт детской гастроэнтерологии Росмедтехнологий»


Защита состоится «___» __________ 2010 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России» по адресу: 117997, Москва, Ленинский проспект д. 117, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан «______»_____________________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Чернов В.М.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) до настоящего времени остаются одной из наиболее серьезных и нерешенных проблем в педиатрии и гастроэнтерологии. По тяжести течения, частоте осложнений, и летальности болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК) занимают одно из ведущих мест в структуре болезней ЖКТ (Григорьева Г.А., Мешалкина Н.Ю., 2007).

В последние годы отмечается стремительный рост НЯК и, особенно, БК во всем мире, включая индустриально развитые страны, где тенденция роста наиболее высока. Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в последние десятилетия является увеличение распространенности данной патологии среди молодых людей (Dermot P.B., et al., 2005). По данным Turunen P., et al. (2006) заболеваемость БК и НЯК у детей и подростков в Финляндии за последнее десятилетие удвоилась. По данным Behrens R., et al. (1996) примерно у 1/3 пациентов первая манифестация ВЗК происходит до достижения ими 18 лет. Beattie R.M. et al. (2006) указывают, что 25% ВЗК манифестируют в детском возрасте. По данным Buller H., et al. (2002) распространённость этих заболеваний у детей в разных странах колеблется от 2,2 до 6,8 на 100000 населения. В Англии и Ирландии частота впервые выявленных ВЗК у детей составляет 5,2 на 100 тысяч (Sawczenko A., et al., 2001).

В Российской Федерации было проведено единственное эпидемиологическое исследование БК в 1997г., согласно которому распространённость БК в Московской области равна 3,5 на 100 тысяч взрослого населения, заболеваемость БК 0,3 на 100 тысяч взрослого населения (Белоусова Е.А., 1997). Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в России является поздняя диагностика и преобладание тяжелых осложненных форм с высокой летальностью (в 3 раза выше, чем в большинстве стран). Эпидемиологических исследований ВЗК в детском возрасте в Российской Федерации не проводилось.

Этиология ВЗК до сих пор остается неизвестной. С современных позиций патогенез ВЗК рассматривают как взаимодействие генетической предрасположенности, нарушенной иммунной реактивности, в первую очередь на уровне слизистой оболочки кишечника, нарушенной барьерной функции кишки и повышенной чувствительности к воздействию факторов внешней среды, в том числе кишечной микрофлоре и специфическим антигенам (Kucharzik T., et al, 2006). Совокупность этих факторов приводит к патологической иммуно-воспалительной реакции в кишечнике с формированием и поддержанием хронического воспаления в пищеварительном тракте.

Генетическая предрасположенность подтверждается многими зарубежными исследованиями. Высокий, 15-кратный риск развития ВЗК отмечается у родственников первой степени родства (Bourma G., Strober W., 2003). Наиболее высокая конкордантность у монозиготных близнецов отмечается при БК и составляет 72%. Генетическую предрасположенность к ВЗК часто связывают с полиморфными вариантами генов NOD2/CARD15, DLG5, OCTN1, OCTN2, TLR4, TNFΑ, IL-1RA и IL-10 (Tomer G., et al., 2003; Ferraris A., et al., 2006; Weersma RK, et al., 2008; Strober W, et al., 2008; Степанова Е.В., 2009). Однако степень влияния этих полиморфных вариантов генов у населения разных стран на развитие ВЗК и клинические проявления заболеваний имеют существенные отличия. Частота полиморфизмов генов в разных популяциях существенно различается (Hugot J.P., et al., 2001; Ogura Y., et al., 2001; Hampe J., et al., 2001).

Точные механизмы иммунопатогенеза БК и НЯК остаются до конца не известными. При обоих заболеваниях отмечается дисфункция эффекторных и регуляторных клеток, как приобретенного, так и врожденного звена иммунной системы, гиперпродукция медиаторов воспаления, что приводит «неконтролируемому воспалению» (Pallone F., et al.; Krajina T., et al. 2003). Однако связь этих процессов с активностью и клиническими проявлениями ВЗК требует уточнения.

С другой стороны, микрофлора кишечника является необходимым и, возможно, ключевым фактором в развитии ВЗК и их поддержании. Этот вывод был подтвержден результатами многочисленных экспериментальных и клинических исследований (Rath H.C., et al., 2001). У больных с ВЗК было выявлено, что кишечная микрофлора претерпевает большие изменения. Они включают в себя высокую сосредоточенность бактерий в мукозном слое, как в воспаленных, так и невоспаленных участках кишечника (Ahmad T., et al., 2002). Однако, имеющиеся данные недостаточны для понимания механизмов развития этих заболеваний и их клинических проявлений.

ВЗК характеризуются чрезвычайным разнообразием клинических проявлений, темпов прогрессирования и развития осложнений, особенно в детском возрасте. Это требует дифференцированных подходов в диагностике и подборе разной степени агрессивности проводимой терапии. Для обеспечения адекватной тактики ведения больных необходимы четкие диагностические и прогностические критерии, которые до настоящего времени отсутствуют.

Таким образом, научные исследования, изучающие патогенетические механизмы развития ВЗК, направленные на разработку информативных критериев диагностики и прогноза, крайне актуальны.

Цель исследования: Установить факторы прогноза развития и течения БК и НЯК у детей на основании комплексного изучения полиморфизма генов, показателей иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника при разных клинических вариантах ВЗК для оптимизации диагностики, лечения и профилактики заболеваний.

Задачи исследования:


  1. Изучить частоту полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c.3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-1RA (VNTR-пилиморфизм), TNFΑ (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом, их ассоциацию с заболеваниями и разными клиническими вариантами течения и относительный риск развития.

  2. Определить особенности иммунного воспалительного процесса у детей при разных вариантах течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита по результатам спонтанной и стимулированной продукции цитокинов в культуре цельной крови и изолированных моноцитов, экспрессии информационной РНК цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов (TLR4, NOD2) в клетках крови и слизистой оболочки кишечника.

  3. Изучить состав пристеночной микрофлоры и оценить значение отдельных ее представителей (группа B. fragilis, группа C. leptum, группа C.coccoides, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella и кластер Atopobium) при разных вариантах течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

  4. Исследовать характер взаимосвязей генетических, иммунных и микробиологических показателей в особенностях развития и течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

  5. Определить диагностически значимые показатели генотипа, иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника в развитии и течении болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

  6. Разработать факторы прогноза развития, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите на основании показателей генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника.

Научная новизна:

Впервые проведено комплексное изучение генотипа, иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника у детей при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите.

Впервые проведено исследование частоты полиморфных вариантов G908R, R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA, -308 g/a гена TNFΑ, -1082 g/a гена IL-10 у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом в Российской Федерации, изучены ассоциации генотипов с данными болезнями и рассчитан риск развития заболеваний.

Впервые показана роль полиморфных генотипов в развитии особенностей течения и прогрессирования заболеваний, выявлены факторы прогноза развития для каждой нозологической формы.

Установлены особенности иммунного воспаления в зависимости от клинических форм, локализации процесса и течения у детей с воспалительными заболеваниями кишечника.

Показана роль пристеночной микрофлоры кишечника, особенности состава и значение отдельных ее представителей при течении разных клинических форм болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

Впервые изучены взаимосвязи генотипа, иммунной реакции и пристеночной микрофлоры кишечника при различных клинических вариантах болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей. Выявлены особенности иммуно-воспалительной реакции у детей с различными вариантами полиморфного генотипа.

Выявлены генетические маркеры прогноза эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.


Практическая значимость:

Выявленные особенности генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника способствуют ранней диагностики, прогнозированию активности, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Показано, что прогноз течения и исхода болезни Крона и неспецифического язвенного колита должен строиться на комплексной оценке особенностей генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника.

Наиболее диагностически значимыми при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей являются: исследование полиморфных вариантов G908R, R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA, -308 g/a гена TNFΑ, определение популяционного уровня Lactobacillus и Bifidobacterium в биоптатах слизистой оболочки кишечника и уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям, так как позволяют информативно оценить активность и построить прогноз течения заболеваний и эффективности терапии.

Показано, что оценка иммунного воспаления должна базироваться на комплексном исследовании уровня цитокинов в нативной сыворотке, их спонтанной и стимулированной продукции в культуре крови и экспрессии их генов в крови и тканях, так как исследование только сывороточного уровня не отражает истинного характера иммуно-воспалительной реакции.

На основании проведенного исследования выявлены факторы прогноза развития, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.


Внедрение результатов работы. Основные результаты исследования внедрены в клиническую практику гастроэнтерологических отделений Российской детской клинической больницы, детской городской клинической больницы № 13 имени Н.Ф. Филатова г. Москвы, отделения гастроэнтерологии НЦЗД РАМН.

Основные научные положения и выводы внедрены в педагогический процесс курса гастроэнтерологии и диетологии ФУВ кафедры госпитальной педиатрии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры поликлинической педиатрии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Результаты исследования использованы при подготовке методических рекомендаций «Воспалительные заболевания кишечника у детей: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит», утверждённые Министерством здравоохранения Республики Бурятия.


Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на совместной научно-практической конференции кафедры детских болезней №2 педиатрического факультета РГМУ, сотрудников отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, отдела гастроэнтерологии с гепатологичсекой группой НЦЗД РАМН, Российской детской клинической больницы и детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы; «Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Неделе» (Москва, 2008); VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008); XV, XVI Конгрессах детских гастроэнтерологов России и стран СНГ» (Москва, 2008, 2009); Первом Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орел, 2008); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); 11-ом Международном Славяно-балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2009» Санкт-Петербург, 2009); 2-ом международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург – Пробиотики-2009» (Санкт-Петербург, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции детских диетологов (Москва, 2009); 11 Международном медицинском форуме «Современные медицинские технологии на службе охраны здоровья россиян» (Нижний Новгород, 2010); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 11 статей опубликовано в журналах, рецензируемых ВАК.
Объём и структура диссертационной работы: диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав материалов собственного исследования, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы, содержащего ___ источников ( ___ отечественной и ____ зарубежной литературы). Работа проиллюстрирована ___ таблицами и ___ рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Работа проводилась в период 2006–2010 годов на базе отделений гастроэнтерологии Российской детской клинической больницы, Научного центра здоровья детей РАМН, Государственного научного центра колопроктологии Росмедтехнологий, ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы и инфекционного отделения №2 ДГКБ № 9 им. Г.Н. Сперанского г. Москвы.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН, иммунологические исследования – на базе отдела молекулярной гематологии, онкологии и иммунологии ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, микробиологические – на базе кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета Росздрава и лаборатории иммунохимической диагностики ФГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Всего было обследовано 216 пациентов с ВЗК и 209 человек контрольной группы. Среди пациентов с ВЗК у 97 (44,9%) больных была диагностирована БК и у 119 (55,1%) детей – НЯК.

Диагноз ВЗК основывался на основании оценки жалоб, данных анамнеза заболевания, клинического осмотра и данных лабораторных инструментальных исследований. В обязательном порядке диагноз БК и НЯК верифицировался морфологически. В соответствии с Монреальской классификацией (2005) все пациенты с БК были определены в подгруппы с учетом возраста к моменту установления диагноза, локализации процесса, характера течения заболевания. Для оценки клинической активности при БК использовался педиатрический индекс активности, у пациентов с неспецифическим язвенным колитом был использован клинический индекс активности Rachmilewitz.

Молекулярно-генетические исследования включало исследование образцов ДНК 88 не родственных пациентов с БК и 101 – с НЯК, а также 126 человек из группы популяционного контроля. Оценивалось наличие полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c.3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-1RA (VNTR-пилиморфизм), TNFΑ (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) Образцы ДНК выделены из цельной крови, забор 1 мл крови проводился одновременно с забором крови для планового биохимического исследования из локтевой вены. Генетическое исследование включало следующие этапы: выделение геномной ДНК, мультиплексную лигазную реакцию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ), анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ-анализ), электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

Иммунологические исследования включало определение уровня TNF-α, TNF-β, IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IL-4, IL-5, IL-1b, IL-12p70 с использованием цитометрического метода в нативной сыворотке и в четырех образцах культуры цельной крови и изолированных моноцитов, прошедших стимуляцию белками бактериальных оболочек: LPS (липополисахарид), MDP (мурамилдипептид) и комбинации LPS и MDP. Исследование проведено с помощью цитометра BDFaxCantoFlowCytomix (США) и набора антител к цитокинам BMS810FF (Bender MedSistem GmbH Viena Austria). Выделение моноцитов проводилось методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads MyPure Monocyte Kit 2 for Untouched human cells, Invitrogen Осло, Норвегия).

Изучение уровня экспрессии мРНК IL-12p70, IL-1-b,2,4,5,6,8,10,TNF-α, TNF-β, IFN-γ, NOD2 и TLR4 проводилось в крови и в биоптатах слизистой оболочки сигмовидной кишки у детей с ВЗК и условно здоровых детей. Забор материала для исследования проводился в пластиковую микропробирку, содержащую фиксатор RNA-Later (Ambion, Texas, USA). Выделялась РНК из архивных образцов с использованием набора «Рибо-Сорб» (АмплиСенс, Россия, Москва) ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора в соответствии с методикой производителя. Постановка реакции обратной транскрипции осуществлялась в соответствии с методикой производителя. ПЦР проводили в автоматическом режиме, используя амплификатор Dyad. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием праймеров синтезированых ЗАО «Синтол» (Россия). Детекция флуоресценции в пробирках в режиме реального времени производилась с использованием двух каналов. Канал Orange использовался для детекции флюоресценции внутреннего контроля (GAPDH-ген), длина волны - возбуждение 585 нм, эмиссия 610 нм. Канал Yellow-возбуждение 470 нм, эмиссия 510 нм.

Изучение представителей пристеночной микрофлоры (группа Clostridium coccoides, группа Clostridium leptum, группа Bacteroides fragilis, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella, и кластер Atopobium) проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с помощью группоспецифических праймеров. Выделение ДНК из образцов проводилось по методу Boom с использованием набора ZR Genomic DNA Tissue MiniPrep (ZYMO RESEARCH) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использование готовых 2,5Х ПЦР-смесей («Синтол») в приборе АНК-32 («Синтол»). Флуоресценция в пробирках детектировалась в режиме реального времени на канале FAM (возбуждение 492 нм, эммиссия 520 нм). Значения пороговых циклов определялись автоматически прибором.

Антитела класса IgG к бифидобактериям и лактобациллам определяли с помощью иммуноферментного анализа. Учет результатов на спектрофотометре при длине волны 492нм. Оптическую плотность растворов в каждой ячейке измеряли с помощью многоканального автоматического горизонтального фотометра “Titertech MultiscanМС” фирмы “Flow Laboratories” (Англия).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ BIOSTAT и STATISTICA 6.0. В обработку результатов входил анализ распределения признаков и их числовые характеристики. В случае, если выборка подчинялась закону нормального распределения, для анализа использовались критерии параметрической статистики с вычислением средней и стандартного отклонения, при сравнении признаков применялся T-тест. В случаях ненормального распределения, в анализе полученных результатов использовались критерии непараметрической статистики с вычислением медианы и 25%-ой и 75%-ой перцентилей. При сравнении двух независимых признаков использовался критерий Манна-Уитни, а при сравнении зависимых признаков - парный критерий Уилкоксона. Для сравнения долей использовался критерий углового преобразования Фишера. При сравнении однородных величин различия считались достоверными при p<0,05. В целях выявления характера взаимодействия между показателями, характеризующими изменение в организме ребёнка, анализировалась линейная корреляция Пирсона (R) или ранговая корреляция Спирмена (Rs). Корреляционная связь при коэффициенте корреляции до 0,5 расценивалась как низкая, 0,5-0,7- умеренная, 0,7-0,9- сильная. Также проводился расчет рисков с определением соотношение шансов (OR, Odds Ratio) и относительного риска (RR, Risk Ratio). Значение этих показателей считались значимыми, если их 95% доверительный интервал не включал в себя единицу.

Характеристика исследуемых групп.

Нами было обследовано 216 пациентов с ВЗК в возрасте от 2 месяцев до 33 лет, средний возраст составил 13,2±3,97 лет. Длительность заболевания варьировала от 1 месяца до 16,3 лет и в среднем составила 3,9 ± 0,5 года. Среди больных с ВЗК пациенты мужского пола составили 55,5% (120 пациентов), женского пола – 44,4% (96 пациента). Среди больных ВЗК у 97 (44,9%) больных была диагностирована БК и у 119 (55,1%) детей – НЯК.

Группу пациентов с БК (n-97) составили дети (75,3%) в возрасте от 2 месяцев до 17 лет 2 месяцев и взрослые больные (24,7%) в возрасте от 18 до 33 лет, заболевание у которых манифестировало в детстве. Средней возраст группы составил 15,90,72 лет. Длительность БК в среднем составила 6,7±1,2 года. Распределение пациентов с БК по полу: мужского пола 59 человек (60,8%) и женского пола 38 (39,2%). Группу больных с НЯК (n-119) составили дети в возрасте от 1,5 лет до 17 лет 10 мес. Средний возраст пациентов с НЯК равен 10,8 ± 0,9. Длительность заболевания 3,2±0,7 года. Распределение больных с НЯК по полу: мужского пола 60 детей (50,4%) и женского пола 59 детей (49,6%). Распределение пациентов с ВЗК по возрасту на момент проведения исследования представлено в таблице 1.

Таблица 1



Распределение пациентов с ВЗК по возрасту




Возраст в годах

0–3

4 – 6

7 – 11

12–17

18 –33

БК

1(1,0%)

2 (2,1%)

12 (12,4%)

58 (59,8%)

24 (24,7%)

НЯК

15 (12,6%)

14 (11,8%)

16 (13,4%)

74 (62,2%)

0

ВЗК

16 (7,4%)

16 (7,4%)

28 (13,0%)

132 (61,1%)

24 (11,1%)

Контрольную группу составило 209 человек. Для различных исследований использовались разные контрольные группы. При генетических исследованиях в качестве группы сравнения использовался популяционный контроль, который был представлен образцами ДНК (n-126) людей из банка ДНК лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН, из них лица мужского пола составили 56,6%, женского пола – 46,4%. Средний возраст в этой группе составил 30,7±22,4 года. Для иммунологических исследований контрольную группу составили 59 соматически здоровых детей, госпитализированных для проведения планового хирургического лечения по поводу неосложненных форм крипторхизма и пупочной грыжи. Забор крови у них проводился в предоперационном периоде. Средний возраст этой группы 9,6 ±1,7 лет, 56,1% оставляли мальчики и 43,1% – девочки. Для микробиологических исследований контрольную группу составили 24 условно здоровых детей. Средний возраст этой группы 11,8 ±1,1 лет, 52,4% оставляли мальчики и 47,6% – девочки.

Манифестация ВЗК происходила во все возрастные периоды от 2 месяцев до 17 лет. Средний возраст манифестации ВЗК в исследуемой группе составил 9,31±0,8 лет, в том числе при БК 11,5±1,1 лет, при НЯК – 7,4±0,9 лет. Распределение больных БК и НЯК по возрасту манифестации представлено в таблице 2.

Таблица 2.



Возраст манифестации заболевания при БК и НЯК.

Возраст

БК (n-97)

НЯК (n-119)

абс.

%

абс.

%

До 1 года

5

5,1

12

10,1

1 – 3 года

3

3,1

24

20,2

4 – 6 лет

9

9,3

19

16,0

7 – 10 лет

16

16,5

28

23,5

11 лет и старше

64

66,0

36

30,2

В группе пациентов с БК преобладали больные с илеоколитом (44%), изолированный илеит отмечался у 29%, изолированный колит – у 18%, поражение верхних отделов ЖКТ – у 9%. Среди больных с БК клиническая ремиссия отмечалась у 9%, высокая клиническая активность – у 27%, умеренная клиническая активность – у 32%, низкая – у 32%. Эндоскопическая ремиссия выявлялась у 5%, высокая активность – у 18%, умеренная – у 32%, низкая – у 45%. Самым частым вариантом течения БК у исследуемых пациентов было воспалительное (нестенозирующее непенетрирующее) – у 86,4%, стенозирующее – у 13,6%, пенетрирующее – у 9,1%, у одного ребенка отмечались и стенозы, и свищий. Перианальное проажение было выявлено у 13,6% больных. Внекишечные проявления отмечались у 54,5% пациентов с БК. Самыми частыми внекишечными проявлениями были суставной синдром (31,8%), патология печени (13,6%), поражение кожи и слизистых (9,1%). Снижение минеральной плотности костных тканей отмечено у 27% больных с БК.

В группе детей с НЯК преобладали пациенты с тотальным колитом (63%), левосторонний колит был отмечен у 5,2%, проктосигмоидит – у 21,3%, проктит – у 10,5%. Среди больных с НЯК клиническая ремиссия отмечалась у 36%, высокая клиническая активность – у 20%, умеренная клиническая активность – у 18%, низкая – у 26%. Эндоскопическая ремиссия выявлялась у 10%, высокая активность – у 18%, умеренная – у 26%, низкая – у 46%. Внекишечные проявления отмечались у 28,2% детей с НЯК. Самыми частыми внекишечными проявлениями были патология печени (12,8%), суставной синдром (10,3%), поражение кожи и слизистых (7,69%). Снижение минеральной плотности костных тканей отмечено у 19% детей с НЯК.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании с целью изучения частоты встречаемости полиморфных вариантов (ПВ) генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c.3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-1RA (VNTR-полиморфизм), TNFΑ (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) у детей с БК и НЯК мы обследовали 196 пациентов с ВЗК, из них 88 пациентов с БК и 108 детей с НЯК. Среди обследованных больных у 180 человек (92,3%) выявлен тот или иной ПВ исследуемых генов. Только у 15 пациентов (7,7%) не были выявлены полиморфные варианты генотипов. Среди пациентов с диким вариантом генотипа у 4 человек был установлен диагноз БК (4,54% от всех больных с БК), а у 11 человек – НЯК (10,2% от всех больных с НЯК).

Полиморфный вариант G908R гена NOD2/CARD15 (табл. 3) обнаружен только у 5 (5,68%) больных с БК и у 6 (5,55%) больных с НЯК. Данный полиморфизм выявлялся только в гетерозиготном состоянии, как у больных с ВЗК, так и в популяционном контроле. Аллельная частота G908R гена NOD2/CARD15 при БК составила 2,84%, а при НЯК – 2,78%. В контрольной группе аллельная частота равна 1,98%. Частоты аллелей G908R при БК и НЯК в исследуемых и контрольной выборках не имеют статистически значимые отличия (р>0,05), что не подтверждает ассоциация наличия полиморфных аллелей G908R гена NOD2 с БК и НЯК.

Таблица 3.



Частота полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 у детей с ВЗК.




Полиморфные аллели

G908R

R702W

c.3020insC

БК

n-88


НЯК

n-108


К

n-126


БК

n-88


НЯК

n-108


К

n-126


БК

n-88


НЯК

n-108


К

n-126


Всего полиморф-ных аллелей (n)

5

6

5

15

8

8

26

8

15

Гетерозиготы (n)

5

6

5

11

8

8

18

4

15

Гомозиготы (n)

0

0

0

2

0

0

4

2

0

Аллельная частота (%)

2,84

2,78

1,98

8.52

3,70

3,17

14,8

3,70

5,95

p (с К)

>0,05

>0,05




<0,01

>0,05




<0,01

>0,05




OR

1,44

1,04

2,84

1,17

3,003

0,61

95%ДИ

0,41-5,7

0,42-4,96

1,18-6,86

0,43-3,18

1,41-5,34

0,25-1,46

Полиморфный вариант R702W гена NOD2/CARD15 обнаружен у 13 (14,8%) больных с БК, у 11 больных (12,5%) в гетерозиготном, а у 2 (2,27%) – гомозиготном состоянии. При НЯК ПВ R702W гена NOD2/CARD15 был обнаружен у 8 больных (7,41%) и только в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота R702W у пациентов с БК составила 8,52%, при НЯК – 3,7%. В контрольной выборке аллельная частота равна 3,17%. Статистически значимые отличия в частоте полиморфизма R702W с популяционным контролем были выявлены только у пациентов с БК (p<0,05), что свидетельствует об ассоциации полиморфизма R702W с БК. У больных с НЯК статистически значимых отличий частоты полиморфной аллели R702W выявлено не было и ассоциации не выявлено.

При исследовании относительного риска развития БК в зависимости от наличия полиморфного генотипа NOD2/CARD15 было установлено, что наличие у пациента полиморфного варианта аллели R702W достоверно (p<0,05) повышает риск БК в 2,84 раза.

Полиморфный вариант c.3020insC гена NOD2/CARD15 выявлен у 22 пациентов с болезнью Крона (25%), в том числе в гомозиготном состоянии у 4 (4,54%) больных, в гетерозиготном состоянии у 18 (20,4%) больных. При НЯК данный полиморфизм был у 6 больных (5,55%), их них у 4 (3,7%) в гетерозиготном, а у 2 (1,85%) – в гомозиготном состоянии. Аллельная частота c.3020insC гена NOD2/CARD15 среди больных БК составила 14,8%, при НЯК – 3,7%. Гомозиготы по c.3020insC выявлены только среди больных и отсутствуют в контрольной группе. Аллельная частота в группе популяционного контроля составила 5,95%. Нами выявлены статистически значимые отличия (p<0,01) в частоте встречаемости полиморфизма c.3020insC между контрольной и исследуемыми выборками только при БК, что свидетельствует об ассоциации полиморфизма c.3020insC с БК. Ассоциации аллели c.3020 insC с НЯК не выявлено. Относительного риска развития БК при наличии аллели c.3020insC гена NOD2/CARD15 достоверно (p<0,05) повышается в 2,74 раза.

Оценка значения гомозиготного полиморфного генотипа NOD2/CARD15 в исследуемых группах не представляется возможной из-за отсутствия такого генотипа в контрольной выборке.

Полиморфный вариант R30Q гена DLG5 (табл. 4) выявлен в гетерозиготном состоянии у 16 (19,7%) пациентов с БК и у 14 (13%) больных с НЯК. Аллельная частота R30Q гена DLG5 у пациентов с БК составила 9,88%, при НЯК – 6,48%. Аллельная частота R30Q в популяционном контроле составила 8,33%. Частоты встречаемости R30Q между исследуемой и контрольной группой не имеют статистически значимых отличий (p>0,05), и ассоциация полиморфного варианта 30Q гена DLG5 не подтверждена ни с БК, ни с НЯК.

Таблица 4.

Частота полиморфных вариантов генов DLG5, OCTN1, OCTN2 у детей с ВЗК.





Полиморфные аллели

R30Q

гена DLG5

L503F

гена OCTN1

-207G/C

гена OCTN2

БК

n-81


НЯК

n-108


К

n-126


БК

n-81


НЯК

n-108


К

n-126


БК

n-81


НЯК

n-108


К

n-126


Всего полиморф-ных аллелей (n)

16

14

21

59

88

67

68

80

78

Гетерозиготы (n)

16

14

21

37

48

43

36

46

48

Гомозиготы (n)

0

0

0

11

20

12

16

17

15

Аллельная частота (%)

9,88

6,48

8,33

36,4

40,7

25,6

42,0

37,0

31,0

p (с К)

>0,05

>0,05




<0,05

<0,01




<0,05

>0,05




OR

1,21

0,76

1,58

1,90

1,61

1,31

95%ДИ

0,61-2,39

0,38-1,54

1,03-2,42

1,29-2,80

1,07-2,43

0,89-1,93

Полиморфный вариант L503F гена OCTN1 выявлен у 48 пациентов с болезнью Крона (59,3%), в том числе в гомозиготном состоянии у 11 (13,6%) больных, в гетерозиготном состоянии у 37 (45,7%) больных. При НЯК данный полиморфизм был у 68 больных (63%), их них у 20 (18,5%) – в гомозиготном состоянии. Аллельная частота L503F гена OCTN1 при БК составила 36,4%, при НЯК – 40,7%. В контрольной выборке полиморфный вариант L503F выявлен у 55 из 126 человек (43,6%), из них у 12 человек (9,5%) в гомозиготном состоянии, и аллельная частота 503F составила 25,6%. Статистически значимые отличия (p<0,05) в частоте данного ПВ выявлены между больными с БК и контрольной выборкой, а также между больными с НЯК и контролем (p<0,01). Это свидетельствует об ассоциации полиморфизма L503F гена OCTN1, как с БК, так и НЯК. Относительного риска БК при наличии полиморфизма L503F гена OCTN1 достоверно (p<0,05) повышается в 1,58 раза, а риск развития НЯК возрастает в 1,9 раза (p<0,05).

При анализе роли гомозиготного полиморфного генотипа L503F гена OCTN1 статистически значимая ассоциация (p<0,05) выявлена только у больных НЯК. Риск развития НЯК при таком генотипе возрастает до 2,16 раза (OR=2,16, 95%-ДИ 1,10-4,65, p<0,05).

Полиморфизм -207 G/C гена OCTN2 он был выявлен у 52 пациентов с болезнью Крона (64,2%), в том числе в гомозиготном состоянии у 16 (19,6%) больных. При НЯК данный ПВ был у 63 больных (58,3%), из них у 46 (42,6%) в гетерозиготном, а у 17 (15,7%) – в гомозиготном состоянии. Аллельная частота -207 G/C гена OCTN2 при БК составила 42%, при НЯК – 37%. Аллельная частота 207С в группе популяционного контроля составила 31%. Статистически значимые отличия (p<0,05) в частоте встречаемости полиморфизма -207 G/C гена OCTN2 были выявлены только между больными с БК и контрольной выборкой. При НЯК ассоциация с аллелью -207 G/C гена OCTN2 не выявлено. При анализе гомозиготного полиморфного генотипа -207 G/C гена OCTN2 статистически значимой ассоциации не было выявлено ни при БК, ни при НЯК.

При оценке относительного риска развития исследуемых заболеваний в зависимости от наличия полиморфизма -207 G/C гена OCTN2 было установлено, что наличие у пациента полиморфной аллели достоверно (p<0,05) повышает риск БК в 1,61 раза.

Полиморфный вариант D299G гена TLR4 (табл. 5) выявлен у 13 (16%) пациентов с БК, в том числе в гомозиготном состоянии у трех (3,7%) больных, в гетерозиготном состоянии у 10 (12,4%) больных. При НЯК данная полиморфная аллель выявлена у 15 (13,9%) больных, из них у 2 (1,85%) в гомозиготном и у 13 (12%) – в гетерозигоном состоянии. Аллельная частота D299G гена TLR4 среди больных с БК составила 9,88%, при НЯК – 7,87%. В контрольной выборке полиморфные аллели D299G выявлены у 30 человек (23,8%), в трех случаях (2,38%) выявлен в гомозиготном состоянии. Аллельная частота D299G в группе популяционного контроля составила 13,1%. По данным нашего исследования аллельная частота D299G при БК и при НЯК ниже, чем в контрольной выборке, и различия в аллельной частоте между исследуемыми и контрольной выборкой статистически незначимы (р>0,05), ассоциация полиморфного варианта D299G гена TLR4 с БК и НЯК не доказана. При анализе гомозиготного полиморфного генотипа также не выявлена статистически значимая ассоциация ни при БК, ни при НЯК

Таблица 5.

Частота полиморфных вариантов генов TLR4, TNFΑ, IL-10 у детей с ВЗК.





Полиморфные аллели

D299G

гена TLR4

-308 g/a

гена TNFΑ

-1082 g/a

гена IL-10

БК

n-81


НЯК

n-108


К

n-126


БК

n-81


НЯК

n-108


К

n-126


БК

n-81


НЯК

n-108


К

n-126


Всего полиморф-ных аллелей (n)

16

17

33

18

20

33

2

2

1

Гетерозиготы (n)

10

13

27

14

20

31

2

2

1

Гомозиготы (n)

3

2

3

2

0

1

0

0

0

Аллельная частота (%)

9,88

7,87

13,1

11,1

9,26

13,1

1,23

0,9

0,4

p (с К)

>0,05

>0,05




>0,05

>0,05




>0,05

>0,05




OR

0,73

0,57

0,83

0,68

3,14

2,35

95%ДИ

0,39-1,37

0,31-1,05

0,45-1,53

0,38-1,22

0,28-34,9

0,21-26,0
скачать файл


следующая страница >>
Смотрите также:
Шумилов петр Валентинович патогенетические факторы развития и течения болезни крона и неспецифического язвенного колита у детей
744.81kb.
Абдулганиева диана ильдаровна
674.83kb.
Социокультурные факторы экономического развития
107.62kb.
3 Сценарии развития России до 2020 года
3408.64kb.
Модуль 1 Основы внутренней медицины (болезни органов дыхания, болезни органов кровообращения, ревматические болезни, болезни органов пищеварения) Текстовые тесты
2273.01kb.
Завгородний Дмитрий Анатольевич семейные ценности и ориентации российской молодежи в условиях демографического кризиса: факторы влияния и тенденции развития
422.44kb.
Как нетрудно догадаться, популяции, существующие сами по себе, без взаимодействия с внешними условиями это ситуация совершенно нереалистичная. На популяцию действуют разнообразные экологические факторы
155.07kb.
«Факторы и инструменты развития метрополитенских регионов» 21-23 октября 2013 г. Головной организатор
94.7kb.
«Отдых детей и подростков в загородных лагерях. Часть 1»
37.3kb.
• 3 группа для детей с тяжелым нарушением речи в возрасте от 4 до 7 лет
53.76kb.
Реферат на тему: "Наследственные болезни человека и возможности их лечения"
310.87kb.
1. Михаил Федорович Алексей Михайлович Федор Алексеевич Иоанн V алексеевич Петр I алексеевич (Великий) Екатерина I алексеевн Петр II алексеевич Анна Иоанновна Иоанн VI антонович 10
205.27kb.